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异育银鲫IgM单克隆抗体的制备及其应用 下载：57 浏览：305

郭宝琴1,2 魏畅1 王轶南1 李强1 《中国水产学报》 2022年6期

摘要:
为制备抗异育银鲫Carassius auratus gibelio IgM单克隆抗体，以单克隆抗体为工具构建鲫血清中鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)特异性抗体酶联免疫检测技术，运用硫酸铵盐析结合Protein A亲和层析法，从异育银鲫血清中分离、纯化免疫球蛋白IgM。结果表明：经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析显示，纯化的血清IgM主要有两条蛋白带，相对分子质量分别为82 000和25 000,分别为异育银鲫IgM的重链和轻链；以纯化的IgM免疫BALB/c小鼠，利用杂交瘤技术获得了5株抗异育银鲫IgM单克隆抗体，分别命名为8G1、7C6、8C2、8C5和5C2;抗体分型结果显示，8G1、8C2、8C5和5C2均为IgG1亚型，7C6为IgG2b亚型；免疫印迹分析显示，5株单抗均可特异性识别相对分子质量为25 000的IgM轻链分子；间接免疫荧光分析显示，5株单抗均可与异育银鲫脾脏中部分白细胞发生特异性结合，阳性细胞表面呈现绿色点状荧光信号；用鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)病毒粒子包被酶标板，以抗异育银鲫IgM单抗作为检测一抗，碱性磷酸酶标记羊抗鼠Ig作为检测二抗，构建了鲫血清中CyHV-2特异性抗体酶联免疫检测技术，进一步优化显示，该技术中最佳单抗为8C5,最佳二抗稀释度为1∶2 000,鲫血清最佳稀释度为1∶20。研究表明，本研究中成功制备了抗异育银鲫IgM单克隆抗体，并以此为工具构建了检测鲫血清中CyHV-2特异性抗体酶联免疫检测技术，研究结果可为今后开展异育银鲫特异性免疫应答研究及CyHV-2疫苗效果评价提供科学参考。

鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF4蛋白在杆状病毒表达系统中的表达及其免疫原性分析 下载：62 浏览：371

孟少东1,2 姜新宇2 葛恒2 胡光耀2 杨大佐1 张家林2 李强2 《中国水产学报》 2021年4期

摘要:
为进一步研究鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2, CyHV-2)ORF4蛋白的功能,通过PCR扩增CyHV-2 ORF4基因,并构建重组穿梭质粒pFastBac HTA-ORF4,将其转化至大肠杆菌DH10 Bac感受态细胞后获得重组杆粒Bacmid-ORF4;采用脂质体法转染Sf9细胞后,利用间接免疫荧光法(IFA)和Western blot鉴定重组蛋白,采用His亲和层析柱纯化重组蛋白,并通过小鼠免疫试验分析其免疫原性。结果表明:转染72h后Sf9细胞逐渐呈现出细胞变圆、细胞核明显增大的形态变化;间接免疫荧光结果显示,重组杆状病毒感染的Sf9细胞中出现了明显的绿色荧光;Western blot结果显示,纯化的CyHV-2 ORF4蛋白能够与抗His单抗发生特异性反应;小鼠免疫试验显示,纯化的CyHV-2 ORF4蛋白能诱导小鼠产生特异性免疫反应。研究表明,本研究中获得的CyHV-2 ORF4蛋白有较好的免疫原性,为CyHV-2 ORF4蛋白的功能解析提供了良好材料。
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