低温是影响凡纳滨对虾养殖的重要因素。为探明凡纳滨对虾在应对低温胁迫下的分子机制，通过RACE方法对凡纳滨对虾胸腺肽(Lvthy)基因进行克隆，并对其序列特征进行分析，并通过荧光定量PCR对其组织分布表达及低温胁迫下的表达谱进行分析，最后通过siRNA干扰的方法对其表达量进行敲降，对其在凡纳滨对虾低温胁迫下的功能进行验证。Lvthy基因cDNA全长1765bp,开放阅读框长度729bp,编码242个氨基酸。组织分布分析结果显示，Lvthy基因在对虾不同组织中均有表达，在胃组织中表达量最高，其次是在肠道、心脏和脑组织。低温胁迫试验结果显示：Lvthy基因在低温刺激1h后表达量开始上调；3h后表达量达到最高，是正常状态下的2.7倍；随后Lvthy基因表达量开始下降。RNAi干扰试验结果显示，敲降Lvthy基因后，凡纳滨对虾在低温胁迫下的存活率仅为31%,显著低于对照组存活率(83%)。试验结果表明，胸腺肽在凡纳滨对虾响应低温胁迫的生理过程中发挥重要的作用，本试验结果可为胸腺肽在甲壳动物应对低温胁迫下的适应机制研究奠定基础。

Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(GCRV)基因片段S11编码外衣壳蛋白VP35。为深入探究VP35蛋白在病毒增殖中发挥的作用，实验扩增了S11基因并插入载体pCMV-3×flag中，构建pCMV-3×flag-S11真核表达质粒，转染草鱼肾细胞(CIK)后感染Ⅱ型GCRV，收集感染后的上清液与细胞。首先利用实时荧光定量PCR中相对定量的方法检测细胞样品中Ⅱ型GCRV-S6基因的mRNA。结果显示，过表达VP35在病毒mRNA水平促进Ⅱ型GCRV的增殖；然后扩增S6基因并插入到载体pET-32a(+)中，构建重组原核表达质粒，纯化Ⅱ型GCRV-VP4蛋白并制备多克隆抗体，用Western blot检测收集的细胞样品中的VP4蛋白，结果表明过表达VP35在病毒蛋白水平促进Ⅱ型GCRV的增殖；最后使用pET-32a-S6质粒作为阳性标准质粒并制作标准曲线，建立Ⅱ型GCRV病毒基因拷贝数的绝对定量检测方法，利用该方法检测细胞上清液中的病毒颗粒，结果表明过表达VP35增加Ⅱ型GCRV病毒拷贝数。本研究从3个维度证明过表达VP35蛋白促进Ⅱ型GCRV增殖，有助于深入解析VP35蛋白功能，也为进一步探究Ⅱ型GCRV的致病机制提供理论基础。

为制备抗异育银鲫Carassius auratus gibelio IgM单克隆抗体，以单克隆抗体为工具构建鲫血清中鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)特异性抗体酶联免疫检测技术，运用硫酸铵盐析结合Protein A亲和层析法，从异育银鲫血清中分离、纯化免疫球蛋白IgM。结果表明：经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析显示，纯化的血清IgM主要有两条蛋白带，相对分子质量分别为82 000和25 000,分别为异育银鲫IgM的重链和轻链；以纯化的IgM免疫BALB/c小鼠，利用杂交瘤技术获得了5株抗异育银鲫IgM单克隆抗体，分别命名为8G1、7C6、8C2、8C5和5C2;抗体分型结果显示，8G1、8C2、8C5和5C2均为IgG1亚型，7C6为IgG2b亚型；免疫印迹分析显示，5株单抗均可特异性识别相对分子质量为25 000的IgM轻链分子；间接免疫荧光分析显示，5株单抗均可与异育银鲫脾脏中部分白细胞发生特异性结合，阳性细胞表面呈现绿色点状荧光信号；用鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)病毒粒子包被酶标板，以抗异育银鲫IgM单抗作为检测一抗，碱性磷酸酶标记羊抗鼠Ig作为检测二抗，构建了鲫血清中CyHV-2特异性抗体酶联免疫检测技术，进一步优化显示，该技术中最佳单抗为8C5,最佳二抗稀释度为1∶2 000,鲫血清最佳稀释度为1∶20。研究表明，本研究中成功制备了抗异育银鲫IgM单克隆抗体，并以此为工具构建了检测鲫血清中CyHV-2特异性抗体酶联免疫检测技术，研究结果可为今后开展异育银鲫特异性免疫应答研究及CyHV-2疫苗效果评价提供科学参考。

为探究叉头框转录因子Foxl2基因(forkhead transcription factor gene 2)在斑鳢Channa maculata性腺发育过程中的作用，采用RT-PCR和RACE技术克隆出斑鳢Foxl2基因，利用qRT-PCR解析Foxl2基因在雌雄斑鳢1龄成鱼组织、不同发育时期性腺中的表达情况，以及外源性激素诱导后雌雄斑鳢性腺中Foxl2的表达变化，通过酶联免疫法测定性腺不同发育时期雌雄斑鳢血清中的雌性激素(estrogen, E)总含量，并利用免疫组化技术检测性腺中Foxl2蛋白表达的细胞类型。结果表明：克隆获得斑鳢Foxl2 cDNA序列全长为1 939bp,开放阅读框(ORF)为921bp,共编码306个氨基酸；组织表达分析显示，Foxl2在卵巢中表达量最高且极显著高于精巢(P<0.01),但在鳃和脑组织中雄鱼表达量显著高于雌鱼(P<0.05);性腺发育时期表达分析显示，Foxl2在卵巢中表达量高于精巢，且在孵化出膜后105d时，卵巢中表达量达到最高，精巢中表达量最低，两者表达量存在极显著性差异(P<0.01),血清中雌激素总含量变化与之相似；免疫组织化学检测显示，Foxl2蛋白表达于斑鳢卵巢成熟卵母细胞周围的颗粒细胞，精巢中未检测到Foxl2表达信号；经外源性类固醇激素17α-乙炔基雌二醇(17α-ethynylestradio, EE2)和17α-甲睾酮(17α-methyltestosterone, MT)处理后，卵巢中Foxl2的表达均受到抑制，但精巢中表达水平被EE2上调，被MT下调。研究表明，Foxl2基因在斑鳢性腺中呈现明显的性别二态性表达，推测其参与卵巢的发育和维持，通过外源激素诱导，Foxl2可能响应性类固醇激素的调节，本研究从mRNA和蛋白层面初步揭示了Foxl2在斑鳢性腺发育中的重要作用，为深入研究其性别分化机制及性别控制技术提供了科学参考。

为评价Claudin-3与Claudin-12基因在珍珠龙胆石斑鱼Epinephelus fuscoguttatus♀×E.lanceolatus♂生长和肠道黏膜屏障中的作用，通过同源克隆及RACE PCR技术克隆珍珠龙胆石斑鱼Claudin-3和Claudin-12基因的全长，采用qRT-PCR技术分析Claudin-3和Claudin-12基因在珍珠龙胆石斑鱼脑、鳃、皮肤、肌肉、肝脏、胃、前肠、中肠、后肠、头肾、体肾、脾和心脏13种组织的表达情况，并通过饲料精氨酸干预评估上述两个基因在肠道的表达情况。结果表明：Claudin-3 cDNA全长序列为1 544bp,包括一个153bp的5′末端非翻译区(UTR)和743bp的3′UTR,Claudin-3的开放阅读框(ORF)为648bp,可编码215个氨基酸的蛋白，预测该蛋白相对分子质量为23 100;Claudin-12 cDNA全长序列为1 236bp,包括一个118bp的5′UTR和92bp的3′UTR,Claudin-12的ORF为1 026 bp,可编码341个氨基酸的蛋白，预测该蛋白相对分子质量为37 400;系统进化树和氨基酸序列比对显示，珍珠龙胆石斑鱼Claudin-3与斜带石斑鱼亲缘关系最近，同源性最高，一致性高达98.14%,珍珠龙胆石斑鱼Claudin-12与䲟的亲缘关系最近，同源性最高，一致性高达91.75%;Claudin-3和Claudin-12基因在被检测的13种组织中均有表达，Claudin-3 mRNA在鳃和体肾中表达量最高(P<0.05),其次是中肠和肝脏，Claudin-12在脑中表达量最高(P<0.05),其次是中肠和后肠；饲料中精氨酸含量为3.06%时，珍珠龙胆石斑鱼增重率及肠道Claudin-3和Claudin-12基因表达水平显著高于1.96%和3.74%精氨酸组(P<0.05)。研究表明，Claudin-3和Claudin-12基因表达在适宜精氨酸水平的影响下上调，可维护石斑鱼肠道黏膜屏障完整，并促进鱼体生长。

为了研究淋巴因子基因(T-cell acute lymphocytic leukemia，tal)在香港牡蛎中的免疫功能，实验采用cDNA末端快速扩增技术(rapid-amplification of cDNA ends，RACE)克隆了香港牡蛎tal的cDNA全长序列，命名为Chtal，该基因全长812bp，其中5非编码区17bp，3非编码区135bp，开放阅读框(open reading frame，ORF)660bp，编码219个氨基酸，相对分子质量25.11ku，理论等电点5.80。多序列比对和系统进化树结果显示，Chtal与长牡蛎、美洲牡蛎和海蜗牛tal同源性较高，证明了该基因是软体动物tal家族的一个成员。荧光定量PCR结果显示，Chtal在香港牡蛎血淋巴细胞中表达量最高，其次是心脏、鳃和消化腺。在溶藻弧菌和溶血性葡萄球菌刺激后，Chtal表达量显著上调，分别在24和12h达到最高水平，随着时间的增加该基因的表达量逐渐下降。亚细胞定位结果显示，Chtal在细胞核中表达。活体注射重组TAL蛋白能够显著提高淋巴细胞的数量，通过Edu增殖实验进一步证实了tal具有促进香港牡蛎血淋巴细胞再生的功能。本研究初步揭示了香港牡蛎tal参与了淋巴细胞再生，为深入研究该基因在牡蛎抗病中的功能提供了依据。

研究表明弹性蛋白酶(elastase， Ela)参与调控嗜水气单胞菌引起的细菌性溃疡病，对控制鱼类养殖中免疫疾病有重要作用。本研究根据已报道脊椎动物的Elas基因序列设计特异性引物，通过RT-PCR和RACE技术克隆获得黄鳍鲷Ela基因(AlEla)cDNA序列全长，并对其进行生物信息学分析。结果显示，AlEla基因全长为946 bp，包含807 bp的开放阅读框，编码269个氨基酸，含有16个氨基酸信号肽的亲水性稳定膜外蛋白，定位于细胞外基质，具有3个O-糖基化和15个磷酸化的潜在位点。编码的成熟AlEla蛋白预测相对分子质量27 509 u，等电点为6.05。氨基酸序列同源性比对发现，AlEla与鲷和鲆的Elas2的同源性为84.76%～99.26%，处于系统进化树上同一分支，表明它们的亲缘性相近。AlEla具有Elas的保守结构，如Tryp-SPc结构域、丝氨酸蛋白酶催化三联体、保守的半胱氨酸残基以及在C端含有GDSGGPL序列等，揭示该酶有丝氨酸蛋白酶的催化活性。对AlEla蛋白的二级结构分析显示，α-螺旋、β-转角、β-折叠和无规则卷曲所占的比例分别为17.84%、7.06%、24.54%和50.56%。三级结构分析推测α-螺旋和β-折叠对于AlEla蛋白的空间构象可能有着重要作用。本研究从黄鳍鲷肌肉中成功克隆AlEla基因并分析其生物信息学特征，为后续研究AlEla参与调控鱼类免疫疾病的机制提供理论基础。