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异育银鲫IgM单克隆抗体的制备及其应用 下载：57 浏览：305

郭宝琴1,2 魏畅1 王轶南1 李强1 《中国水产学报》 2022年6期

摘要:
为制备抗异育银鲫Carassius auratus gibelio IgM单克隆抗体，以单克隆抗体为工具构建鲫血清中鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)特异性抗体酶联免疫检测技术，运用硫酸铵盐析结合Protein A亲和层析法，从异育银鲫血清中分离、纯化免疫球蛋白IgM。结果表明：经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析显示，纯化的血清IgM主要有两条蛋白带，相对分子质量分别为82 000和25 000,分别为异育银鲫IgM的重链和轻链；以纯化的IgM免疫BALB/c小鼠，利用杂交瘤技术获得了5株抗异育银鲫IgM单克隆抗体，分别命名为8G1、7C6、8C2、8C5和5C2;抗体分型结果显示，8G1、8C2、8C5和5C2均为IgG1亚型，7C6为IgG2b亚型；免疫印迹分析显示，5株单抗均可特异性识别相对分子质量为25 000的IgM轻链分子；间接免疫荧光分析显示，5株单抗均可与异育银鲫脾脏中部分白细胞发生特异性结合，阳性细胞表面呈现绿色点状荧光信号；用鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)病毒粒子包被酶标板，以抗异育银鲫IgM单抗作为检测一抗，碱性磷酸酶标记羊抗鼠Ig作为检测二抗，构建了鲫血清中CyHV-2特异性抗体酶联免疫检测技术，进一步优化显示，该技术中最佳单抗为8C5,最佳二抗稀释度为1∶2 000,鲫血清最佳稀释度为1∶20。研究表明，本研究中成功制备了抗异育银鲫IgM单克隆抗体，并以此为工具构建了检测鲫血清中CyHV-2特异性抗体酶联免疫检测技术，研究结果可为今后开展异育银鲫特异性免疫应答研究及CyHV-2疫苗效果评价提供科学参考。

异育银鲫肿瘤坏死因子α蛋白的原核表达、纯化及促凋亡活性分析 下载：40 浏览：362

崔正一1,2 胡光耀2 姜新宇2 王佳2 于新然1 乔帼2 李振2 李强2 张家林2 《中国水产学报》 2020年4期

摘要:
为了实现异育银鲫Carassius auratus gibelio肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor,TNF-α)在大肠杆菌表达系统的高效表达,并研究其在促鲫鱼细胞凋亡中的作用,采用PCR的方法从体质量(15±1) g异育银鲫脾脏组织中扩增TNF-α基因,构建pET28a-TNF-α重组质粒并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,通过Ni亲和层析柱纯化并采用尿素浓度梯度透析法进行蛋白复性,最后用rTNF-α蛋白处理鲫鱼鳍条细胞,通过Hoechst 33258染色法和荧光定量PCR技术,分析异育银鲫经rTNF-α蛋白处理后鲫鱼细胞的凋亡情况及凋亡相关基因Caspase 3和Caspase 8的表达变化。结果表明:诱导后获得了相对分子质量约为23 000的蛋白条带,且重组蛋白以包涵体形式存在;Western-blot显示,纯化产物与抗His单抗在相对分子量约23 000处出现了明显的反应条带,表明成功地实现了异育银鲫TNF-α的重组表达;进一步采用Hoechst 33258染色后发现,与正常细胞相比,经rTNF-α蛋白处理后的细胞核染色加深,呈碎块状浓染现象;荧光定量PCR显示,rTNF-α蛋白处理能使凋亡相关基因Caspase 3和Caspase 8 mRNA表达水平呈明显的上调趋势。研究表明,本文成功实现了异育银鲫TNF-α蛋白在大肠杆菌中的高效表达,且rTNF-α蛋白可诱导鲫鱼鳍条细胞发生凋亡,该工作将为后续研究TNF-α蛋白的抗病毒作用奠定基础。

一种佐剂新材料在嗜水气单胞菌灭活疫苗浸泡免疫异育银鲫中的应用效果 下载：93 浏览：477

任燕 时云朵 石存斌 吴淑勤 《水产研究进展》 2018年1期

摘要:
为研究蓖麻油聚乙二醇单酯葡萄糖苷(CPMG)在细菌灭活疫苗浸泡免疫中的佐剂作用,将CPMG和嗜水气单胞菌灭活疫苗联合施用,二次浸泡免疫异育银鲫后饲养在室内玻璃缸中,用实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测加强免疫后2、4、7、11、14和21 d脾脏中Ig M、IL-1β、C3、C-凝集素和溶菌酶的m RNA表达量,首次免疫30 d后用同源菌株活菌攻击实验鱼；同时,用含CPMG、山莨菪碱复合佐剂的灭活疫苗浸泡免疫异育银鲫一次后饲养在池塘网箱中,定期抽取血液检测血清抗体效价并用同源菌株人工感染实验鱼。结果显示,CPMG佐剂组和无佐剂组的5个免疫相关基因的相对表达量显著高于对照组,CPMG组Ig M基因较无佐剂组更早表达,补体C3、C-凝集素以及溶菌酶的基因表达量更高或表达持续时间更长。血清抗体效价在免疫后2周达到160,6周达到峰值640,12周降低为40。室内玻璃缸中二次免疫30 d后,CPMG组的平均相对保护率达到70.6%,复合佐剂组达到88.2%,均显著高于无佐剂组的56.0%。池塘网箱中一次浸泡免疫30、60和120 d后,平均相对保护率分别为54.6%、44.0%和12.5%。研究表明,CPMG与嗜水气单胞菌灭活疫苗共同浸泡免疫异育银鲫,增强了脾脏中Ig M、IL-1β、C3、C-凝集素以及溶菌酶基因表达,提高了异育银鲫抗嗜水气单胞菌感染的能力。
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