1材料与方法
1.1土壤样品
石油污染土均源自徐州某输油站库，图1为采集到的土样，抽取表层2～15cm的污染土。
1.2培养基
LB培养基:酵母浸出粉5g/L，胰蛋白陈 10g/L，氯化钠10g/L，琼脂 15g/L，共同配制200mL，将pH值更改为 7.0，121C条件下灭菌 20min。
降油培养基:NaC1 10g，NH4C1 0.50g，KH2P04 0.50g，K2HP04 1.0g，MgS04 0.50g，CaC12 0.1g，KC1 0.10 g，FeS04·7H20 0.01g，蒸水 1000L，95号石油4g，H值7.2,121C灭菌20min。
1.3实验方法
1.3.1菌种的分离与鉴定
称石油污染土1.0g，将其倒入一根试管内（已装满9.0mL刻度的无菌生理盐水），转入漩涡混合器中完全地混匀。以梯度稀释法来逐步稀释，稀释后的梯度依次是10-2、10-3、10-4以及10-5。从10-3、10-4、10-5中分别吸取20μL剂量的稀释液，同时将培养基置于32℃条件的培养箱中进行倒置培养，时间24h。结束后，仔细观察菌落形态，从中抽选形态不一样的单菌落，转入固体培养基内进行接种，如此反复。将纯化完毕的菌株，倒进培养基斜面上开始接种，接着培养大概24h，放入一个4℃冰箱内进行存储。对菌种各自的DNA加以提取，同时开始PCR扩增，得到1500bp条带，以Sanger法进行逐步测序，将得到的结果和GenBank数据库加以对比，找到菌株对应的类别。
1.3.2优良降解菌株的筛选
将纯化后得到的菌种，转入一个LB培养基中开始接种，刻度为200mL，32℃、180r/min再次培养，进行24h，以600nm为界限，检测菌液此时的吸光度。吸取2mL菌液，倒进一个200mL降油培养基中重新开始接种，32℃、180r/min继续培养，2、4、6d接连检测培养基中具体的石油含量，计算对应的石油降解率。各菌种都要先后接受3组平行试验，取均值，对石油降解能力较高的菌种予以筛选。
1.3.3石油降解率的测定方法
将降解完毕的培养液放入一个离心机中（100r/min），20min之后就需要吸取其中的上清液，转入其他锥形瓶，每1L上清液中需要掺加5mL硫酸予以酸化，掺加40mL刻度的石油醚，提取培养基里面剩下的石油，并测定它的质量。
1.3.4菌种降解性能的测定
1）单因素试验 基质需要选定为LB培养基，结合表1显示的实验方案，分别培养菌种。20h后，从中吸取20μL菌液将其掺加至降油培养基中，再次培养6d，测定出培养基里面的残余石油含量，同时计算最后的石油降解率。
2）以单因素试验为依据，对石油降解能力较高的菌种，完成正交实验。根据实验方案设定的培养条件，完成培养。借助Design-expert软件，分析实验结果，明确菌种降解石油最为适宜的培养条件。
2结果与分析
2.1石油降解菌的分离与鉴定
试验分离得到的9株菌株，菌1～菌9，观察9种菌各自的特点，分离纯化后完成生理生化实验。根据NCBI网站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）里面的Blast来对已知序列、测序结果加以比对，明确相似度，结果如下：菌1、2、3分别是铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），假单胞菌属（Pseudomonas），苍白杆菌属（Pleurobacter），4、5、6分别为博得特氏菌属（Bordetella），戈登氏菌属（Gordonia），同温层芽孢杆菌（Bacillus）还有菌洛菲不动杆菌（Acinetobacter），此外就是还有琼氏不动杆菌（Acinetobacter junii）等，它们的相似率都不低于99.9%。
2.2优良降解菌的筛选
培养6d，计算9株菌各自的石油降解率，表1。
表19株菌在6d后显示的石油降解率
从表3看出，菌1、2、3、4、5各自的石油降解率均在60%以上，可见菌1、2、3、4、5有能力对石油进行降解，意味着铜绿假单胞菌、苍白杆菌属还有博得特氏菌属等都可以对石油进行快速降解。同时，这5种菌也没有半点致病性，不会污染环境。
2.3菌株降解性能的测定
2.3.1单因素试验结果
从图1看出，关于5种菌，温度对石油降解率表现出类似的影响。当温度低于35℃，温度上升后，石油降解率也会逐步上升。当温度超出35℃，石油降解也会逐渐下降。对这5种菌而言，35℃相对也比较适宜。
图1不同培养温度下石油降解率的曲线图
从图2看出，pH值对石油降解率表现出一致的影响。当pH=7.5时，菌4石油降解率也会接近峰值，其他4种菌，当pH=7时，其石油降解率同样也会达到最大值。
图2不同pH值下石油降解率对应的曲线图
经过24h的特定培养，菌1降解率处于最大值，大于24h后逐步降低。20、24h，其石油降解率相对比较平稳。不过，超出24h之后再次降低，剩下3种菌，在培养20h时都会接近于降解的最大值。
图3培养时间对5种菌石油降解率的影响
2.3.2正交实验结果
根据单因素试验，正交实验如表2。
按照正交实验方案来开展实验，测定各组的残余石油量，并计算出石油降解率，如表2。
根据软件分析，5个模型各自的F值依次是91.75、2042.52、14452.75、1091.50和79620.51，P值均未超过0.0001，提示回归方程十分显著，其失拟项均不明显。可见，5个模型均表现出不错的模拟性。
利用Design-Expert 8.0.6软件，对5个模型进行计算，结果如下：菌1，其最佳培养温度、PH值分别是32.14℃、7.00，最理想的培养时间20.12h。据此，石油降解率达到70.1674%；菌2，其上述指标分别是32.00℃，7.01和20.07h，由此得到算出石油降解率理想值为76.4168%;菌3，各项指标依次为32.03℃、7.00和20.05h，石油降解率最终是75.6766%;菌4，各项指标依次是31.84℃、6.97、19.84h，由此得到石油降解率77.5246%；菌5的各项指标分别是32.02℃、7.00和20.06h，其降解率达到73.2506%。
实践中，上述最佳条件下显示的参数没有办法实现。由于因素对结果没有过多的影响，故作如下变动：菌1，将培养温度更改为32.1℃，时间为20h。根据上述条件，石油降解率最终为70.17%；菌2，将pH值更改为7，时间20h。根据此条件来开展实验，得知石油降解率最终为76.42%；菌3，将其培养温度更改为32.0℃，时间20h，根据此条件，其降解率达到75.66%；菌4，温度31.8℃，pH值7.0，时间20h，根据此条件，石油降解率最终是77.50%；菌5，将培养温度更改为32℃，时间20h，根据此条件，石油降解率最终显示为73.22%。
3 结论
1）本次石油污染土分离而来的菌种共有9种：铜绿假单胞菌、博得特氏菌属以及戈登氏菌属，同时包括同温层芽孢杆菌、洛菲不动杆菌还有琼氏不动杆菌等，对石油有不错的降解能力。
2）经筛选，得到石油降解能力相对较高的5种菌，分别为铜绿假单胞菌、博得特氏菌属还有戈登氏菌属等，它们的石油降解率都不低于60%。
3）5种降解能力相对较强的菌降解石油，其最佳培养条件依次是：假单胞菌属、苍白杆菌属、铜绿假单胞菌或是博得特氏菌属，其最佳温度都是32℃；pH值都是7.0；时间20h。铜绿假单胞菌、假单胞菌属、苍白杆菌属、博得特氏菌包括戈登氏菌这几个菌种，其石油降解率依次是70.12%、76.42%、75.66%、77.50%以及73.22%。同时，5种菌都不会对人体产生任何的致病性，没有环境污染，能够为生物修复筛选和提供适宜的菌种。
参考文献：
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