肿瘤的发病率和死亡率逐年上涨，2020年全球肿瘤新发病例达上千万，严重威胁人类生命健康[1]。大量临床研究数据显示，化学药物虽提高了多种恶性肿瘤的治愈率，但较强的毒副作用及耐药性等问题无法避免。并且目前研究对肿瘤复杂的生物学行为仍缺乏全面的认识。而中医治疗肿瘤从多角度、整体观点辨证施治，中药通过多成分、多靶点治疗肿瘤，不易产生耐药性，优势显著，已经成为抗肿瘤新药研发的新方向[2]八角莲为小檗科八角莲属植物八角莲Dysosma versipellis (Hance) M.Cheng的干燥根茎及根，《神农本草经》中以其鬼臼之名列为下品，后续的《证类本草》、《本草纲目》等著名医籍均有记载[3]。八角莲具有清热解毒、化痰散结、祛瘀消肿的功效，用于治疗痈疖肿痛、咽喉肿痛、毒蛇咬伤等症[4]。现代研究发现八角莲的化学成分复杂，主要包括木脂素类、黄酮类和蒽醌类及其他一些成分[5]。目前关于八角莲抗肿瘤作用的研究主要集中在单体及提取物抑制肿瘤细胞增殖方面，但目前对八角莲抗肿瘤作用机制的研究报道较少，缺乏从细胞及分子水平系统全面地阐述八角莲抗肿瘤的作用机制。
网络药理学是一门研究“药物-靶点-疾病”之间复杂关系的交叉学科，与中药“多成分-多靶标-多通路”作用机制恰恰契合[6]。近年来多用于科学地阐释中药的药理和毒性机制以及中药药效物质基础和安全性评价研究[7]。本研究借助网络药理学的方法分析八角莲抗肿瘤作用的潜在活性成分，揭示作用靶点及信号通路，以阐明八角莲抗肿瘤分子机制，对后续进一步研究其作用机制提供更为系统的分析思路和科学依据。
1材料与方法
1.1八角莲活性成分及其潜在靶点的预测
利用TCMSP数据库（http://lsp.nwu.edu.cn/），以口服利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18作为筛选条件[8]，获得八角莲符合以上条件的化合物。在PubChem数据库中检索各候选成分或利用 ChemDraw Professional 16.0软件绘制其结构式，保存为SMILE化学式并上传Swiss Target Prediction（http://www.swissdock.ch/）数据库获取各化合物对应评分前15的潜在靶点。
1.2肿瘤靶点的获取
以“tumor”为关键词、“Homo sapiens”为限定条件，在人类基因库（https://www.genecards.org/）和PubMed Gene两个数据库中检索筛选得到肿瘤疾病相关靶标。使用Uniprot数据库将所有靶点转化为Uniprot ID格式。
利用在线软件Venny（V2.1.0）将肿瘤相关靶标与活性成分靶标比较，得到八角莲活性成分抗肿瘤作用的潜在靶标。
1.3 活性成分和抗肿瘤靶标网络构建及分析
将八角莲活性成分与筛选出的抗肿瘤作用潜在靶标导入Cytoscape3.7.2软件中，构建活性成分-抗肿瘤潜在靶标网络。图形化网络表示活性成分和抗肿瘤潜在靶标之间的联系和相互作用，网络度（degree）和介数中心性（betweenness，BW）是用于在网络分析中筛选网络节点的2个重要参数。
1.4 蛋白互作分析
应用STRING数据库检索八角莲抗肿瘤潜在靶标的相互作用关系，将其导入Cytoscape软件3.7.2，绘制蛋白相互作用关系网络（PPI），使用Cytoscape软件的Network Analyzer功能对其进行网络分析，根据节点大小和颜色反映Degree的大小，筛选出Degree>20的靶标进一步绘制核心靶点PPI图。
1.5 GO功能和KEGG通路富集分析
通过DAVID数据库对八角莲抗肿瘤潜在靶标进行基因本体（GO）功能和京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，阈值设为P<0.01，进一步说明八角莲抗肿瘤方面的潜在机制。
1.6成分靶点分子对接
采用SYBYL对接软件对八角莲抗肿瘤活性成分和核心靶点进行分子对接验证。通过PDB数据库下载靶点蛋白的3D结构PDB格式，在chem 3D中将化合物转换为pdb格式，用对接软件的surflex-Dock模板进行分子对接。
2结果
2.1八角莲活性成分信息分析
根据筛选条件OB≥30%，DL≥0.18，共获得八角莲活性成分13个，具体信息见表1，其中木脂素类化合物9个，黄酮类化合物2个，蒽醌类化合物1个和甾醇类化合物1个，对应结构见图1。将化合物SMILE化学式上传Swiss Target Prediction数据库预测，选取各化合物排名前15的靶点，共筛选出195个潜在靶点，去除重复项得到119个潜在靶点。
表1 八角莲活性成分表
2.2抗肿瘤靶标预测
在人类基因库（GeneCards）和PubMed Gene两个数据库中检索筛选得到肿瘤疾病相关靶标共4137个，与八角莲潜在靶标进行比较，筛选出抗肿瘤潜在靶标88个，见图1。
图1 八角莲活性成分潜在靶标-抗肿瘤靶标韦恩图
2.3活性成分和抗肿瘤靶标网络构建
在Cytoscape3.7.2软件中，导入八角莲活性成分和抗肿瘤靶标，构建活性成分-抗肿瘤潜在靶标网络，见图2。图中共101个节点（13个活性成分和88个抗肿瘤潜在靶标）和155条边，正方形代表活性成分，圆形代表抗肿瘤潜在靶点，边用在连接活性成分和抗肿瘤潜在靶标。节点的度数表示该节点与其相互联系的其他节点的数目，其度值越大，节点越大颜色越深，越有可能成为该网络的重要节点。八角莲各个活性成分均能作用于多个靶点，细胞色素P4503A4酶（CYP3A4）、表皮生长因子受体(EGFR)、皮质醇受体基因（NR3C1）、细胞色素（CYP2C9）、CYP2C19、糖原合成酶激酶3β基因（GSK3B）、血小板衍生生长因子受体β（PDGFRB）、花生四烯5-脂氧合酶基因（ALOX5）、芳香化酶（CYP19A1）、磷脂酰肌醇3-激酶催化亚基ɑ（PIK3CA）、雷帕霉素靶蛋白（MTOR）、胰岛素样生长因子（IGF1R）、脾脏酪氨酸激酶（SYK）等靶点能与多个活性成分连接，说明这些靶点有可能是八角莲抗肿瘤核心靶点。体现了一药多靶及一靶多药的复杂网络关系符合中药多成分、多靶点相互作用的特征。
图2 C-T网络
2.4核心靶标相互作用网络分析
利用STRING数据库得到八角莲抗肿瘤潜在靶标的相互作用关系，导入Cytoscape软件，构建蛋白相互作用关系网络，见图3，根据靶点的度值，筛选出排名前10的靶点构建核心靶点互作网络，见图4。网络中的节点代表靶标，边代表靶标之间的联系。靶标的Degree值大小通过节点颜色和大小来体现，Degree值越大，节点越大，颜色越深，边的combine score值越大，靶点之间关联程度越高，边越粗。核心靶标包括表皮生长因子受体（EGFR）、雷帕霉素靶蛋白（MTOR）、雌激素受体1（ESR1）、丝裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）、基质金属蛋白酶9（MMP9）、磷脂酰肌醇3-激酶催化亚基ɑ（PIK3CA）、丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、雄激素受体（AR）、髓样细胞白血病蛋白1(MCL1)、细胞色素P4503A4酶（CYP3A4），详细信息见表2。Degree值越大，说明靶标在此网络中越关键，进而推测这10种蛋白在抗肿瘤过程中起到不可忽视的作用。
图3 靶标蛋白相互作用网络
图4 核心靶标蛋白相互作用网络
2.5 GO和KEGG富集分析结果
表2 关键节点信息（Degree>20）
Table 2 Key targets and topological parameters
通过DAVID数据库进行GO基因功能注释和KEGG通路富集分析，设定P＜0.01，得到八角莲抗肿瘤的潜在靶标的生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）三个部分共20条信号，见图5。探讨八角莲潜在靶点的功能分布情况。其中在生物过程中，排名较前的有蛋白质自磷酸化（protein autophosphorylation）、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路（transmembrane receptor protein tyrosine kinase signaling pathway）、肽基丝氨酸磷酸化（peptidyl-serine phosphorylation）、肽基苏氨酸磷酸化（peptidyl-threonine phosphorylation）等；在细胞组分中，排名较前的有质膜（plasma membrane）、磷脂酰肌醇3-激酶复合物（phosphatidylinositol 3-kinase complex）及细胞内（intracellular）；在分子功能中，排名较前的有ATP结合（ATP binding）、类固醇结合（steroid binding）、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性激活（transmembrane receptor protein tyrosine kinase activity）及蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性激活（protein serine/threonine kinase activity）等，表明八角莲通过参与多种生物学过程发挥抗肿瘤作用。
通过KEGG通路富集结果，按照显著性大小列举前15条通路，见图6。主要涉及癌症通路（Pathways in cancer）、癌症的中央碳代谢（Central carbon metabolism in cancer）、前列腺癌（Prostate cancer）、催乳素信号通路（Prolactin signaling pathway）、急性粒细胞白血病（Acute myeloid leukemia）、粘着斑（Focal adhesion）、PI3K-Akt信号传导通路（PI3K-Akt signaling pathway）、胶质瘤（Glioma）、ErbB信号通路（ErbB signaling pathway）、孕激素介导的卵母细胞成熟（Progesterone-mediated oocyte maturation）等。
图5 GO功能富集分析（P<0.01）
图6 KEGG通路富集分析（P<0.01）
3讨论
恶性肿瘤是严重危害人类健康且目前还缺乏有效的方法对其进行根治。八角莲味辛温，《神农本草经》中早已以“鬼臼”之名记述，现代药理学研究发现八角莲具有抗肿瘤、抗病毒、抑菌、免疫调节等多种生物学活性[9]。近些年来，其含有的鬼臼毒素及其木脂素类化合物因具有显著抗癌活性在肿瘤的治疗上具有广泛的应用前景[10]。研究人员以鬼臼毒素为母体进行结构修饰，依托泊苷，替尼泊苷是最早应用且具有较好疗效的两种鬼臼毒素的糖苷类衍生物，己被用作睾丸癌、小细胞肺癌、非霍奇金淋巴癌等癌症的一线联合化疗常规药[11-12]。但是目前关于八角莲抗肿瘤作用机制研究较少，因此运用网络药理学探究八角莲抗肿瘤作用机制十分重要。
本研究通过OB和DL值筛选出13个活性成分，木脂素类成分包括鬼臼苦素、鬼臼毒素、去氧鬼臼毒素等，黄酮类成分包括山奈酚和槲皮素，蒽醌类成分八角莲蒽醌以及甾醇类成分β-谷固醇，且每个成分均能作用于多个抗肿瘤靶点，表明这些活性成分与抗肿瘤密切相关。其中，鬼臼毒素[13]、鬼臼苦素[14-15]、鬼臼毒酮[16]、去氧鬼臼毒素[17-18]等木脂素类化合物对肿瘤细胞生长具有有效的抑制作用。黄酮类化合物槲皮素[19]和山奈酚[20]具有较好的抗肿瘤作用。
通过构建八角莲活性成分-抗肿瘤靶标网络和PPI网络分析，推断EGFR、MTOR、ESR1、MAPK8、MMP9、PIK3CA、MAPK1、AR、MCL1、CYP3A4、CYP2C9、CYP2C19、GSK3B、NR3C1D等靶点可能是八角莲抗肿瘤核心靶点。如EGFR，是原癌基因c-erb-B1的表达产物，其在大多数肿瘤中过表达或突变，借助一系列复杂交叉的信号转导通路的调节失控，使得细胞生长失控和恶化，从而抑制肿瘤细胞的凋亡[21]。再如MTOR是PI3K-Akt信号传导通路的重要下游蛋白激酶，被体内的生长因子、营养及能量等信号激活后，能加速细胞内蛋白质的合成，为肿瘤细胞的生长提供物质基础，是治疗癌症的重要靶点[22]。ESR1与雌激素结合后，可以促进乳腺癌细胞的异常增殖，与乳腺癌的发生发展密切相关[23]。MAPK8在乳腺癌、食道癌、结肠癌等许多人类肿瘤中呈持续的激活表达，其能通过磷酸化细胞核内的丝氨酸/苏氨酸位点，使其转录活性增强，在细胞增殖、分化和肿瘤转化等过程中起重要作用[24-25]。MMP9在癌细胞介导的细胞外基质降解中起关键作用。在子宫内膜癌[26]、宫颈癌[27]等癌症的生长发展、癌细胞转移等过程中发挥着重要作用。本研究中预测的靶标与已知报道的药理机制基本相吻合，说明通过网络药理学预测率较高。
GO功能注释显示八角莲靶点抗肿瘤靶点涉及的生物学过程主要有有蛋白质自磷酸化、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路、肽基丝氨酸磷酸化、肽基苏氨酸磷酸化等。通过KEGG通路富集显示其相关通路主要涉及癌症通路、癌症的中央碳代谢、前列腺癌、催乳素信号通路、急性粒细胞白血病、粘着斑、PI3K-Akt信号传导通路、胶质瘤、ErbB信号通路、孕激素介导的卵母细胞成熟等。如PI3K-Akt信号通路是一条与肿瘤疾病密切相关的通路，其主要作用为抑制细胞凋亡、促进增殖。PI3K-Akt信号通路在大多数恶性肿瘤中出现调控异常 [28]。ErbB信号通路是目前胆囊癌分子机制研究中的热点[29]，ErbB信号通路靶基因的异常激活能增强胆囊癌细胞增殖和侵袭力，是胆囊癌的关键性驱动基因。ErbB家族包括四个酪氨酸激酶受体，当与其配体（如EGF、TGF、AR等)结合后，激活下游相关基因（如Akt，MAPK等），从而调控细胞增殖、分化、迁徙和凋亡等活动。
综上所述，本研究通过网络药理学方法对八角莲活性成分进行抗肿瘤靶标预测及通路分析，其治疗过程涉及多成分、多靶点、多通路，符合中药治疗疾病的多靶点特点，揭示了八角莲抗肿瘤潜在分子机制，对八角莲抗肿瘤分子机制进一步的研究提供一定的参考价值。但其关键靶标和调控机制还需要进一步的实验验证。
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作者简介：米文静，硕士研究生，从事中药化学研究。
通讯作者：霍丽妮，博士，教授，从事中药有效成分、结构修饰及生物活性研究。
