统计48种氨基酸性质之间的相关性并分析其对蛋白质二级结构的影响。[方法]用r软件对20种氨基酸性质进行分析。[结果]侧链二面角角度柔性等3种性质与Pα相关系数为0.412、0.832、0.477等,以正相关影响α-螺旋的形成,而可压缩系数与Pα相关系数为-0.293,以负相关影响其形成;疏水介热性等17种性质与Pβ的相关系数为0.536、0.867等,以正相关影响β-折叠的形成,而氨基酸极性等6种性质与Pβ的相关系数为-0.547等,以负相关影响其形成;均方根起伏位移与P_t、Pc的相关系数为0.742、0.73,以正相关影响β-转角和无规则卷曲的形成,而膨松度等19种性质与P_t、Pc的相关系数为-0.635、-0.626等,以负相关影响二者的形成。[结论]氨基酸本身信息对蛋白质二级结构有正或负相关的影响。

旨在探究细胞周期因子Geminin对Cas9在细胞基因组中的编辑效率是否有影响。[方法]将Geminin的前40个氨基酸序列对应的cDNA序列克隆到含靶向COSMC基因的sgRNA的pX459质粒pX459-COSMC-Cas9(wtCas9)上得到能在Cas9蛋白N端融合表达Geminin片段的pX459-COSMC-Geminin-Cas9质粒(Geminin-Cas9)。在人胚胎肾细胞HEK293T或人结肠癌细胞HT29细胞中同时表达wtCas9和Geminin-Cas9蛋白质,检测并比较细胞中Cas9的表达水平和Cas9编辑COSMC基因的效率。[结果]Western Blotting检测发现相比wtCas9质粒,转染Geminin-Cas9质粒的细胞中Cas9表达水平更低,Geminin-Cas9载体对COSMC基因的编辑效率在编辑前期也相对较低,但随着编辑时间的延长,两者的编辑效率趋于一致。[结论]细胞周期因子Geminin的存在能降低Cas9在细胞中的总体表达水平,在编辑前期会在一定程度上降低Cas9的编辑效率,而延长编辑时间又能消除这一影响。

在大肠杆菌表达系统表达UvrB蛋白,优化其表达和纯化的条件,并初步研究其对抗紫外线伤害的功能。[方法]克隆大肠杆菌MG1655菌株UvrB编码序列,采用酶切连接的方法构建表达载体p Waldo-GFP-UvrB,并转入BL21(DE3)表达菌株诱导蛋白质表达,采用Ni-NTA亲和层析以及分子筛层析的方法纯化蛋白质,采用紫外光刺激的方法研究其细胞内功能。[结果]成功构建UvrB表达载体,获得UvrB在BL21(DE3)中重组菌株,其表达条件为22℃,0. 2 mmol/L IPTG诱导20 h,UvrB以可溶蛋白的形式存在。SDS-PAGE结果显示UvrB蛋白质分子量约76 k Da与预期相符;经纯化后UvrB蛋白质得率约为0. 6 mg/L培养基,纯度> 85%,为其进一步研究奠定了基础。[结论]研究克隆并构建了大肠杆菌UvrB蛋白的原核表达体系,优化了其纯化方案,得到纯度> 85%的可溶UvrB蛋白质,为进一步研究UvrB蛋白质功能奠定了基础。

克隆非洲爪蛙prmt5. L基因并分析其在胚胎发育中的时空表达谱。[方法]收集胚胎,提取总RNA,反转录制备c DNA。设计特异引物,PCR扩增prmt5. L基因的ORF序列,连接到p CS2+载体构建p CS2+prmt5. L重组质粒,连接位点为EcoRⅠ和XhoⅠ。经双酶切和测序验证成功构建p CS2+prmt5. L重组质粒。将p CS2+prmt5. L重组质粒用EcoRⅠ酶切,T7 RNA聚合酶转录获得prmt5. L的反义探针。收集不同时期的爪蛙胚胎,固定并脱水后经原位杂交检测prmt5. L在胚胎发育中的表达情况。通过序列比对和进化树分析PRMT5在进化中的保守性。[结果]成功克隆非洲爪蛙prmt5. L基因,原位杂交检测了prmt5. L在早期胚胎中的时空表达谱。序列比对和进化树发现prmt5. L蛋白在进化中非常保守。[结论]成功构建了p CS2+prmt5. L重组质粒。prmt5. L基因在胚胎发育中呈现动态表达且prmt5. L蛋白在进化中非常保守。

探究海洋活性芽孢杆菌MD-5抑菌活性及性质。[方法]采用测定抑菌半径结合OD600及pH确定最佳发酵时间;通过平板琼脂扩散法、平板对峙法测定其抑菌谱;通过测量抑菌圈面积探究加热时间、pH对抑菌活性物质的影响。[结果]在既定培养条件下,该菌株产抑菌活性物质最优的发酵时间为34 h,对多种指示菌具有抑制作用;其发酵上清在100℃下加热2、5、10 min活性保留分别为88.9%、60.4%、38.9%,加热15 min完全失活;当pH 5.0～7.0活性基本不变,pH为酸性活性有所降低,为碱性活性下降明显,pH≥11完全失活。[结论]该菌株具有广谱的抑菌作用,可有效抑制革兰氏阳性菌和部分阴性菌及真菌;所产生的活性物质对温度及pH敏感,高温或碱性环境易于降解失活。

旨在构建雄性激素源性脱发的小鼠毛囊分化发育及周期的模型,并研究雄性激素对雄性激素源性受体(AR)、β-catenin等毛囊发育周期中关键性调控因子在脱发模型小鼠毛囊分化发育中的作用机制的影响。[方法]小鼠皮下注射高浓度睾酮(5 mg/kg)后进行背部皮肤毛发脱毛的同步化处理,通过HE染色观察毛囊发育情况,并利用qPCR、免疫组化检测AR、β-catenin基因和蛋白的表达情况。[结果]睾酮组毛囊首个毛囊兴盛期的发育时间推迟5 d且提前进入休止期,休止期毛囊的毛干与真皮之间间隙增大。睾酮组与对照组相比,AR在毛囊发育早期减弱,第7 d对照组表达下降而睾酮组开始均匀分布于除毛乳头处的整个毛囊。22 d时,对照组毛囊已经进入休止期,AR基本不表达,而睾酮组在外根鞘和连接组织鞘仍可看到有少量表达。睾酮组第5 dβ-catenin在新生的内根鞘、皮质区与毛母质区有较高的表达,随后表达差异与对照组不明显。qPCR结果 AR基因表达与免疫组化趋势基本一致,但雄性激素对β-catenin基因表达的抑制一直持续到了兴盛期后期。[结论]通过建立雄性激素源性脱发的小鼠动物模型,发现雄性激素对毛囊发育分化的作用可能是通过影响AR和β-catenin等毛囊发育关键调控因子来实现的,其具体机制有待进一步研究。

证明醛缩酶A(ALDOA)在肝癌细胞的增殖和迁移作用并探索miR-34a-5p靶向调控ALDOA的分子机制,为肝癌治疗提供潜在的分子靶标。[方法]分子生物学技术构建了ALDOA表达质粒,蛋白质印迹(Western Blotting)和实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测ALDOA的过表达和敲降效果,CCK-8验证细胞的增殖,划痕实验验证细胞的迁移。[结果]在肝癌细胞中过表达ALDOA能促进肝癌细胞的增殖与迁移(P <0.05),敲降ALDOA后肝癌细胞的增殖与迁移受到抑制(P <0.05),miR-34a-5p是通过靶向结合ALDOA的3'UTR抑制其表达从而抑制肝癌细胞的增殖与迁移(P <0.05)。[结论]miR-34a-5p通过靶向ALDOA抑制肝癌细胞的增殖和迁移。

研究与白假丝念珠菌毒力相关的RAPD电泳条带的基因信息,明确这些条带是否来源于已知的毒力调控基因。[方法]通过对相关的白假丝酵母菌重新进行RAPD-PCR,切胶回收,以回收的DNA作为模板进行大量扩增,构建TA克隆,送测序。将获得的DNA信息登录Gen Bank数据库进行比对,寻找与包含这些条带信息的蛋白质。查阅文献,进行生物信息学分析,明确条带的基因信息与已发现的白假丝酵母菌调控基因之间的关系。[结果]白假丝酵母菌RAPD的450 bp条带为Abp1p(ABP1)蛋白的基因片段。[结论]Abp1p(ABP1)基因的过表达可能与下调磷脂酶表达有关,但具体机制有待进一步研究。

验证miR-17-5p对TLRs负向调控因子SIRPα的靶向性,探讨其对抗结核分枝杆菌(MTB)炎症反应的调控作用。[方法]利用生物信息学预测miR-17-5p对SIRPα的靶向性,构建SIRPα野生型和突变型报告载体,利用双荧光素酶报告法、Western Blot、激光共聚焦等技术验证miR-17-5p对SIRPα的靶向性;通过H37Ra感染THP-1巨噬细胞,用miR-17-5p mimics及其inhibitor处理细胞。利用Q-PCR检测H37Ra感染后miR-17-5p的表达;通过免疫荧光、Western Blot和ELISA等技术检测SIRPα和细胞因子TNF-α的表达情况。[结果]H37Ra感染可下调miR-17-5p表达,且随感染复数的增加,下调表达愈加显著;荧光素酶报告法、Western Blot等结果证实miR-17-5p可靶向结合SIRPα3’-UTR,下调SIRPα的表达,进而上调细胞因子TNF-α的表达。[结论]MTB可下调miR-17-5p表达,而miR-17-5p可靶向抑制SIRPα的表达,从而调控巨噬细胞抗MTB的炎症反应。

分析rab7及其下游相关分子rilp和rep1在卡介苗侵袭巨噬细胞过程中的作用。[方法]利用CRISPRERA在线设计鼠源rab7-gRNA序列,构建dCas9调控质粒,比较调控前后rab7、rilp和rep1的mRNA表达量。[结果]成功设计3条rab7-gRNA,构建重组调控质粒p X330S-2-d Cas9-gRNA-T2A-EGFP; BCG感染后,巨噬细胞内rab7及其下游的rilp和rep1的mRNA水平明显上升(P <0. 01); gRNA1调控后,rab7及下游rilp的mRNA水平明显下降(P <0. 05; P <0. 01); gRNA3调控后,rab7及rilp mRNA水平有所下降,但无统计学意义(P> 0. 05)。gRNA1和gRNA3调控对rep1 mRNA水平无明显影响(P> 0. 05)。[结论]在BCG侵染巨噬细胞过程中,rab7作为晚期吞噬体的标志受到dCas9调控后变化明显,rilp作为rab7的下游效应分子,表达水平与rab7的变化一致,而rep1未见明显变化。三者在MTB寄生过程中的作用还有待深入研究。

实现乳酸克鲁维酵母乳糖酶的可溶性表达,并初步研究其酶学性质。[方法]首先克隆了来源于乳酸克鲁维酵母的乳糖酶基因KLLAC,构建pET-KLLAC重组表达载体,并采用蛋白质复性及与pKJE7、pG-KJE8、pGro7、pG-Tf2和p Tf-16伴侣蛋白共表达等方式拟提高其可溶性表达;并优化产酶条件,进一步提高其可溶性;采用ONPG法测定其酶学性质。[结果]在5种伴侣蛋白中pGro7与KLLAC共表达时可溶性最高;产酶最优条件为:阿拉伯糖浓度0. 5 mg/m L,IPTG浓度0. 1 mmol/L,诱导温度20℃;在最优条件下,重组KLLAC与伴侣蛋白p Gro7共表达时,表达量及酶活最高;经纯化后,乳糖酶KLLAC比酶活最高为102. 36 U/mg。该酶的最适温度30℃,最适p H 7. 0。[结论]KLLAC与伴侣蛋白的共表达以及诱导条件的优化,有效提高了该酶的可溶性表达水平、酶活性及稳定性。

在大肠杆菌中表达猪丹毒丝菌spaA基因并纯化重组蛋白。[方法]利用PCR扩增猪丹毒丝菌临床分离株spaA基因,构建重组质粒p GEX-4T-1-spaA,转化大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导表达融合蛋白GST-SpaA,并优化表达条件。最后采用GST琼脂糖纯化树脂纯化,SDS-PAGE和Western Blotting检测。[结果]成功扩增spaA基因,获得重组表达菌株BL21（DE3）/p GEX-4T-1-spaA;在菌体OD600为0. 9时,加入IPTG至终浓度0. 1 mmol/L,34℃诱导6 h的条件下表达效果最好。经SDS-PAGE检测和纯化后得到大小为97 kDa的GST-SpaA; Western Blotting检测结果表明,GST-SpaA具有良好的免疫原性。[结论]成功在大肠杆菌中表达了SpaA蛋白,经纯化得到具有免疫原性的重组蛋白,为后续研制猪丹毒丝菌SpaA蛋白亚单位疫苗奠定基础。

钝齿棒杆菌中有两个黄素还原酶,一个是由frd1编码的F181,另一个是由frd2编码的F188。该文分别对这两个基因进行了敲除,比较二者分别对精氨酸产量的影响。[方法]基因敲除采用的是无痕敲除技术。[结果]敲除frd1的菌株其最终的L-Arg产量达到21. 36 g/L,较出发株提高了10. 6%;葡萄糖消耗速率比出发株慢,但菌体生长量提高显著,提高了约33. 3%。敲除frd2摇瓶发酵产L-Arg的量较出发株提高了3. 15%;菌体生长量介于出发株及敲除frd1的菌株之间;葡萄糖消耗与敲除frd1的菌株相当;敲除frd1的菌株积累NADH最多,产生H2O2最低。[结论]敲除frd1比敲除frd2对提高精氨酸的产量效果显著。

研究分析了杏鲍菇软腐病病原菌北京泛菌的生长特性以及病原菌的快速鉴定方法,从而为杏鲍菇软腐病的防控打下基础。[方法]测定了北京泛菌在不同温度、不同种类抗生素、不同浓度的杀菌剂二氧化氯的生长情况,以及采用特异性引物进行PCR鉴定病原菌。[结果]北京泛菌生长的最适温度28℃,对硫酸链霉素、羧苄青霉素等7类抗生素敏感,在含有50 mg/L的杀菌剂二氧化氯的培养基中不能生长,引物对hrp LF/R、wzx CF/R、tua GF/R和lps DF/R在北京泛菌能够扩增出目的条带。[结论]明确了北京泛菌的生长特性,50 mg/L的杀菌剂能够有效杀灭病原菌,并开发了4对特异性引物用于病原菌的快速、准确鉴定,为杏鲍菇软腐病的防控打下基础。

阐明MKL-1基因在肾透明细胞癌中的表达情况与临床意义。[方法]从TCGA与Oncomine数据库中收集与MKL-1的表达相关的数据,对收集到的数据进行荟萃分析,同时使用Kaplan–Meier方法分析MKL-1的表达量与生存的相关性。[结果]从Oncemine数据库中共收集到154项与MKL-1有关的研究,分析表明在MKL-1在9种癌症中表达上升,且在肾透明细胞癌中的表达显著性上升(P <0. 05)。进一步分析发现MKL-1与癌症患者的特征无显著性关系,但与预后成负相关性。最后通过蛋白质网络预测MKL-1相互作用的蛋白。[结论]基于不同数据库深度挖掘提示MKL-1基因在肾透明细胞癌中高表达,并与肾透明细胞癌的预后有显著相关性,有望被用作肾透明细胞癌的治疗的新靶点。

探讨人TCF7L2基因启动子特征。[方法]从UCSC数据库获得人TCF7L2基因5'调控区2 000 bp序列,利用多种在线软件对启动子、转录因子结合位点、Cp G岛、SNP等进行分析。[结果]5'调控区2 000 bp序列正义链上至少存在5个潜在的启动子,其中-242～-192 bp、-853～-803 bp之间可能包含核心启动子。查找到1个TATA盒,存在1个长度为499 bp的Cp G岛。Ali Baba2. 1、PROMO和JASPAR软件分别预测到241、944、1 035(正义链)个转录因子结合位点。利用conreal程序在人和小鼠TCF7L2基因启动子保守区域内预测到207个共同的转录因子结合位点,涉及到66种转录因子。启动子区发现2个SNP位点。[结论]对人TCF7L2基因启动子进行了生物信息学分析,获得了启动子特征。

利用球孢白僵菌进行固定化生物转化,将底物R-(+)-2-苯氧基丙酸(D-PPA)转化合成产物R-(+)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸(D-HPPA)。[方法]利用海藻酸钠和聚乙烯醇对球孢白僵菌进行包埋处理,并对包埋条件进行累积优化。[结果]4%海藻酸钠和4. 5%聚乙烯醇混合后,再加入2. 5%的氯化钙作为交联剂交联8 h。在此包埋条件下制备的白僵菌凝胶珠,置于30 g/L的D-PPA进行固定化生物转化。反应5 d后,产物浓度最终为29. 9 g/L,平均生产强度为5. 98 g/(L·d),底物转化率为99. 7%。[结论]海藻酸钠和聚乙烯醇可用于白僵菌的固定化,且较游离菌体的生物转化的反应周期缩短28. 6%,平均生产强度增加64. 7%,底物转化率提高17. 7%。

研制一种快速检测人肺炎链球菌(S. pneumoniae)的免疫胶体金层析试纸。[方法]对肺炎链球菌表面蛋白A(pneumococcal surface protein A,PspA)基因序列(Gen Bank:U89711)作生物信息学分析,选取抗原表位强、种内同源性高的片段克隆表达纯化重组蛋白rPspA,并免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体;以双抗夹心法制备胶体金免疫层析试纸,并对其特异性、灵敏度以及稳定性进行验证分析。[结果]制备的胶体金试纸对rPspA最低检测限达到0. 1pg/m L,可在15min内完成对肺炎链球菌的检测,与其他10种重要呼吸道病原菌无交叉反应;试纸条在25℃条件下保存6个月仍具有良好的重复性和稳定性。[结论]PspA蛋白具有高度的表面暴露性和较强的抗原性,可作为Sp的检测标志物,以其抗体为基础制备的胶体金免疫层析试纸,适用于Sp菌感染的临床快速检测。

研究RGS16基因对人肺癌发病及进展的作用。[方法]构建过表达慢病毒载体Lenti-RGS16,感染A549细胞,以CCK-8实验、平板克隆形成实验、划痕实验、FITC/PI染色法检测A549细胞行为包括增殖、克隆形成、迁移、凋亡率变化,以裸鼠成瘤实验检测A549细胞体内生长。[结果]A549细胞中RGS16基因表达量提高3. 6倍,细胞生长、增殖及迁移能力分别降低73%、62. 8%、88%,细胞凋亡率增加3倍;在动物成瘤实验终点时,RGS16过表达组的肿瘤体积比对照组显著减少(240 vs 1090 mm3),瘤体重量也显著降低(0. 33 vs 0. 95 g)。经分析TCGA数据库发现RGS16基因在肺癌组织中表达比正常对照组织中减少52. 8%。[结论] RGS16基因抑制肺癌A549细胞生长、增殖及迁移,促进细胞凋亡。

探讨miR-142下调甲基转移酶DNMT1是否影响乳腺癌细胞的迁移。[方法]过表达miR-142后通过蛋白质印迹和q PCR检测DNMT1的表达。通过荧光素酶报告基因活性测定验证miR-142和DNMT1的3'UTR结合。[结果]在MDA-MB-231细胞中过量表达miR-142后,DNMT1蛋白水平与对照组相比下降,同时,乳腺癌细胞迁移的能力与对照组相比明显下降。敲降DNMT1,乳腺癌细胞迁移的能力与对照组相比也明显下降。并且,miR-142可与DNMT1的3'UTR区域直接结合,抑制DNMT1的表达。[结论]在乳腺癌细胞中,miR-142可通过靶向DNMT1下调其表达来抑制乳腺癌细胞的迁移。