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基于一种新的提取方法的竹黄活性成分对TNF-α介导的炎症反应的影响
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摘要:
目的:通过一种新的提取方法获得竹黄活性组分,并检测其对相关炎症因子及NF-κB 的表达,探索竹黄对TNF-α介导炎症反应的影响。方法:称取干燥竹黄200g,使用微型植物粉碎机粉碎,过50目筛,获得竹黄粗粉,将其置于70℃纯水抽提2次,每次12小时。合并水提取液,减压回收至80ml,加乙醇至醇浓度为80%, 静置6小时,抽滤,得滤渣D,水提后药渣部分用80%乙醇回流提取2次(均为6倍量),合并醇提取液,减压回收溶剂得流浸膏,聚酰胺柱层析,分别以水、40%乙醇、95乙醇洗脱,减压回收溶剂,分别得水洗部分C、40%醇洗部分A和95%醇洗部分B。精确称量A、B、C、D各28mg,50%乙醇溶解并定容至14ml,22μm滤器过滤,配制成2mg/ml储存液,4℃保存。根据实验要求梯度稀释。再通过体外细胞培养的方法,利用小鼠成纤维细胞L929筛选出具有细胞增殖抑制作用的组分并确定50%抑制率浓度(IC50),Hoehest荧光染色观察细胞形态,流式细胞仪检测细胞凋亡;以人脐静脉内皮细胞(HUVECs)为模型,通过竹黄活性组分作用后,检测细胞内粘附分子-1(ICAM-1)、血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)、E-选择素及IKK-α和NF-κB p65的表达。结果:相比于实验组,空白组和对照组的IC50值显著更高,且抑制率显著更低,P<0.05。表明竹黄提取物的细胞毒性较小,且对TNF-α诱导的L929细胞生长抑制具有显著作用。与正常培养组相比,TNF-α组和TNF-α+药物组的ICAM-1、VCAM-1、E选择素、NF-κB p65的表达水平均显著更高,而IKK-α和NF-κB mRNA的表达水平显著更低,P<0.05;但与TNF-α组相比,TNF-α+药物组的ICAM-1、VCAM-1、E选择素、NF-κB p65的表达水平则显著更低,而IKK-α和NF-κB mRNA的表达水平显著更高,P<0.05。表明竹黄提取物对TNF-α诱导炎症反应具有抑制作用。结论:竹黄活性成分对TNF-α介导的炎症反应具有一定的抑制作用,其可能的作用途径主要为降低NF-κB蛋白表达水平,阻断NF-κB通路,减少血清黏附分子产生,降低IKK活性等来减轻炎症反应。